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ARID2调节正常血液缺血中的造血干细胞分化

开放访问发布:2020年12月16日DOI://doi.org/10.1016/j.exphem.2020.12.004

      强调

      • ARID2的丧失在很大程度上没有对稳态血液造皮肌产生影响。
      • ARID2损失导致淋巴谱系再生的损伤。
      • ARID2 NULL HSPCS表现出富含髓样偏置MPP签名的富集。
      • ARID2的丧失导致炎症途径的上调。
      • ARID2 NULL细胞具有LPS的淋巴条件下的增殖缺陷。
      交换机/糖味(SWI / SNF)染色质重塑复合物的系列具有常见的血液杂皮血症。 ARID2蛋白是多种相关BAF(PBAF)的组分,两种主要的SWI / SNF复合物中的一种。在目前的研究中,我们使用了条件Arid2敲除小鼠模型来确定其在正常血液缺陷中的作用。我们发现,ARID2的丧失对稳态血液血液没有可辨别的影响,除了对红细胞生成的效果。然而,在骨髓移植上,ARID2的丧失影响细胞自主方式的HSC分化,导致重建淋巴谱系的能力显着降低。 ARID2敲除细胞的基因表达分析显示髓样偏置多能祖母(MPP)细胞签名的富集,而淋巴偏置的MPP富含野生型,与观察到的表型一致。此外,ARID2敲除细胞显示出具有TLR受体的上调的炎症途径的富集,以及下游信号级级基因。此外,在体外淋巴细胞偏置的生长条件下,ARID2无骨髓细胞的增殖显着受损,这对脂多糖刺激进一步降低。总体而言,这些数据表明,ARID2的损失损失了HSC分化能力,并且这种效果可能通过炎性途径的上调来介导。
      成年血液缺陷来自血液生成干细胞(HSC),其位于骨髓中。 HSC是多能的,成人干细胞,具有较为自我更新的标志能力和区分所有血统。据报道,表观遗传调节剂在HSC功能中起重要作用,它们的失调导致血液恶性肿瘤[
      • 记录贾
      • Crabtree Gr.
      多能性的染色质调节机制。
      ]。这些包括切换/糖味(SWI / SNF)染色质重塑复合物的系列[
      • 威尔逊BG.
      • 罗伯茨CWM.
      SWI / SNF核心重塑者和癌症。
      ,
      • sh a
      • Pollack Jr.
      SWI / SNF突变的光谱,人类癌症中普遍存在。
      ,
      • Buscarlet M.
      • Krasteva V.
      • HO L.
      • 等等。
      BRG的基本作用,BAF染色质重塑复合物的ATPase亚基,白血病维持。
      ]。
      在人类中,SWI / SNF染色质重塑剂系列由两个主要的蛋白质复合物,BRG1相关因子(BAF)和多溴相关BAF(PBAF)组成。这些蛋白质复合物是进化的节约 酿酒酵母酿酒酵母果蝇黑胶基 to humans [
      • Neigebon L.
      • 卡尔森M.
      葡萄糖抑制影响SUC2基因表达调控的基因 酿酒酵母酿酒酵母.
      ,
      • 唐人
      • nogales E.
      • Ciferri C.
      SWI / SNF染色质改造复合物和转录机械影响的结构和功能。
      ]。人的正非复合物共享一套保守的九种蛋白质,包括催化ATP酶和荆棘相关基因1(BRG1)或BRAHMA(BRM),并通过独特的富含富含富含型互动结构域(ARID)蛋白的含量。 ARID1A和ARID1B(分别为BAF250A和BAF250B)对BAF相互排斥,而ARID2(BAF200)对PBAF是独一无二的。蛋白质聚物1(PBRM1 / BAF180)和含有7(BRD7)的溴琼蛋白另外将PBAF与BAF分开[
      • Imbalzano An.
      • 蒲根H.
      • 绿色先生
      • 金斯顿雷
      促进塔塔结合蛋白与核体DNA的结合。
      ,
      • 蒲根H.
      • Imbalzano An.
      • Khavari Pa
      • 金斯顿雷
      • 绿色先生
      人SW1 / SNF复合物激活剂结合的核心破坏和增强。
      ,
      • Phelan ML.
      • SIF S.
      • Narlikar GJ.
      • 金斯顿雷
      从SWI / SNF亚基重建核心染色质重塑复合物。
      ,
      • 王W.
      • 海尔斯J.
      • 薛Y.
      • 等等。
      哺乳动物SWI-SNF复合物的纯化和生化异质性。
      ,
      • 王X.
      • nagl ng.
      • Wilsker D.
      • 等等。
      两个相关的干旱家族蛋白是人SWI / SNF复合物的替代亚基。
      ,
      • kaeser md.
      • 亚洲A.
      • 董迈克
      • yates jr.
      • 艾默生BM.
      BRD7是一种新型的PBAF特异性SWI / SNF亚基,是胚胎干细胞中的靶基因活化和抑制所必需的。
      ,
      • 燕Z.
      • Cui K.
      • 默里DM
      • 等等。
      PBAF染色质重塑复合物需要一种新的特异性亚基BAF200,以调节选择性干扰素响应基因的表达。
      ]。 SWI / SNF复合物与核体结合并使用ATP破坏核小体DNA结合相互作用。这种破坏通过从染色质中滑动或喷射核小体而改变核小体位置,从染色质中影响使用染色质作为模板的生物过程,包括基因转录[
      • 威尔逊BG.
      • 罗伯茨CWM.
      SWI / SNF核心重塑者和癌症。
      ,
      • 萨哈A.
      • Wittmeyer J.
      • 凯恩斯尔
      染色质重塑:组蛋白周围DNA的工业革命。
      ,
      • 洛奇y.
      • 迈尔 - 戴维斯B.
      • Kornberg Rd.
      染色质重塑机制。
      ]。
      据报道,SWI / SNF亚基在正常血液血液中发挥重要作用,包括BAF53,BAF45A和HSC功能中的BAF180 [
      • Krasteva V.
      • Buscarlet M.
      • Diaz-Tellez a
      • 伯纳德马
      • Crabtree Gr.
      • 记录贾
      SWI / SNF样BAF复合物的BAF53A亚基对血液发作干细胞功能至关重要。
      ,
      • Krasteva V.
      • Crabtree Gr.
      • 记录贾
      SWI / SNF样染色质重塑复合物的BAF45A / PHF10亚基对造血干细胞维持至关重要。
      ,
      • 李H.
      • 戴F.
      • 庄L.
      • 等等。
      BAF180通过P21调节细胞衰老和造血干细胞稳态。
      ]; BRG1在红细胞开发和骨髓差异化[
      • Bultman SJ.
      • gebuhr tc.
      • Magnuson T.
      来自染色质重塑的ATP酶活性的BRG1突变揭示了SWI / SNF相关复合物在β-珠蛋白表达和红细胞发育中的基本作用。
      ,
      • vradii D.
      • 瓦格纳斯
      • Doan DN.
      • 等等。
      BRG1,SWI / SNF染色质重塑复合物的ATP酶亚基,是骨髓囊泡的髓细胞髓细胞所必需的。
      ]; smarcd2在肉芽瓶[
      • Priam P.
      • Krasteva V.
      • 卢梭P.
      • 等等。
      SMARCD2 SWI / SNF染色质 - 重塑复合物的亚基通过CEBP依赖性机制介导粒细胞造粒机。
      ];和BRG1,BAF57和BAF155在淋巴膜[
      • 万米
      • 赵克
      • 等等。
      SWI / SNF样BAF复合物的CD4 / CD8表达的互核调节。
      ]。在这项研究中,我们表征了ARID2的损失的造血表型,其中一种蛋白质是将PBAF与BAF复合物区分开。 ARID2的全身纯合体损失是E12.5-E14.5的胚胎致死,因为先天性心脏缺陷[
      • 天X.
      • 张H.
      • 等等。
      心形态发生和冠状动脉发育需要BAF200。
      ]。已经发现ARID2通过调节成骨细胞分化中的特异性基因表达来进行组织特异性功能[
      • 徐F.
      • 鲜花S.
      • 莫兰E.
      ARID2含蛋白的SWI / SNF复合物在组织特异性基因表达中的基本作用。
      ]。此外,ARID2改变了血肿细胞的细胞周期进入。 HepG2细胞的ARID2敲低导致加速G1到S转变[
      • 段Y.
      • 田L.
      • 高Q.
      • 等等。
      染色质重塑基因ARID2靶向细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1以抑制肝癌细胞进展。
      ]。使用条件ARID2敲除小鼠模型,我们表明ARID2的损失导致淋巴谱系再生的损害,并与炎症途径的转录上调相关。

      方法

      小鼠实验,骨髓移植,流式细胞术和分类的完整描述,[3H]胸苷掺入,脂多糖(LPS)刺激和免疫印迹,菌落形成测定,RNA测序,定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR),数据分析,统计方法,引物列表(补充表E1),流式细胞术抗体(补充表E2和免疫印迹抗体(补充表E3)包含在补充材料中(仅提供在线 www.vertebradijital.com.)。

      结果

       稳态血液缺血在很大程度上不受ARID2丧失的影响

      我们使用公布的数据库检查了ARID2 mRNA水平的表达,表明ARID2在所有造血谱系上相对均匀地表达(补充图E1,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)[
      • Lara-Astiaso D.
      • Weiner A.
      • Lorenzo-Vivas E
      • 等等。
      免疫原性:染色型血液形成期间动力学。
      ]。要了解Arid2在正常血液杂物期间的作用,我们从欧洲小鼠突变体归档(EMMA)获得了转基因ARID2敲除 - 第一等位基因小鼠(衍生在C57 / BL6背景上),其中ARID2的外显子4(ARID2tm1a/+)由Loxp网站侧翼[
      违反侵犯者联盟。 Infrafrontier提供突变鼠标资源作为国际科学界的研究工具。
      ,
      • raest m.
      • de castro aa.
      • Gailus-Durner v
      • Fessele S.
      • hrabědeangelis m
      Infrafrontier Consortium.
      InfrAfrontier:欧洲资源研究人类疾病的功能基础。
      ]。将这些小鼠与表达FLP重组酶表达的ActB-FLPE小鼠繁殖,以除去由FRT位点侧翼的基因陷阱盒。然后将所得小鼠与由VAV1或MX1启动子驱动的克雷重组酶(CRE)-Expressing小鼠交叉(图1一种)。 ARID2和EXON 4的切除导致框架和引入内框内停止密码子。在造血和内皮细胞的胚胎发育期间,VAV1启动子在胚胎发育过程中形成了[
      • 乔治亚州P.
      • Ogilvy S.
      • 杜瓦尔H.
      • 等等。
      VAVCRE转基因小鼠:造血和内皮谱系中诱变的工具。
      ]。 ARID2FL / FL. VavCre+ 小鼠诞生于正常的孟德尔比率,我们没有观察到任何公开表型(未显示的数据)。 MX1驱动的CRE表达(MXCRE)是通过注射多胞苷:聚环戊酸(PIPC)在造血和骨髓Niche细胞中诱导的干扰素[
      • velasco-hernandez t
      • SäwénP.
      • 布莱德D.
      • Cammenga J.
      MX1-CRE系统的潜在缺陷:对正常和恶性造血的实验建模的影响。
      ]。 vAvcre的整个骨髓中的切除效率约为65%-95%,MXCRE的80%-99%的切除,在LSK(林CKIT.+Sca1+MXCRE的人口为75%-99%(图1b)。缺失ARID2的总骨髓(BM)细胞不变(图1C)。
      图1
      图1ARID2丧失对稳态血液血液缺血的影响。 (一种) ARID2条件敲除小鼠和代表性PCR基因分型的示意图。 (b) 通过QPCR在整个BM和LSK单元中删除VAV和MX模型中的效率。 (C) 每只鼠标胫骨和股份的总BM细胞性。 (d,e) CBC在PB中; Pb,SPL和BM中成熟的血细胞频率; vAvcre中BM中的HSPC细胞频率和细胞计数 (d) 和mxcre模型 (e)。对VAVCRE模型的8周龄小鼠进行分析。对于MXCRE模型,小鼠在8周内注射PIPC,并在6周后分析。 n =每种基因型3-5只小鼠。 *p value <参数,双尾0.05 t 测试。 CBC.=完全血统; ns.=非特异性。
      为了探讨ARID2丧失对稳态血液血液缺血的影响,我们分析了外周血(PB),脾脏(SPL)和来自ARID2的BMFL / FL. VavCre+ (实验)和VAVCRE+ (对照)成熟血细胞计数和频率的小鼠。进一步评估这些小鼠的BM以进行造血干细胞和祖细胞(HSPC)的变化。 ARID2含氟小鼠的血液计数揭示了一种适度但重要的,红细胞数减少(10.3×106 to 9.6 × 106/毫米3),随着血红蛋白(15.4至14.1g / dl)和血细胞比容(49%至46%)水平降低,表明贫血(图1d)。 B细胞(B220+)Pb中的频率显着降低(45%至37%),而SPL和BM的成熟细胞谱系没有变化(图1D; 补充图E2,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。 HSPC的频率或细胞计数没有显着差异,包括LSK和所有CD150和CD48 LSK子集(LSKCD150+CD48,LSKCD150+CD48+,LSKCD150CD48+,和lskcd150CD48)和下游祖细胞,包括CMP(林CKIT.+Sca1CD34+fcɣrii/三lo),GMP(林CKIT.+Sca1CD34+fcɣrii/三+)MEP(林CKIT.+Sca1CD34fcɣrii/三)和CLP(林CKIT.+Sca1+IL7rα+ Flt3+)在ARID2敲除和VAVCRE模型中的控制之间的BM(图1d)。在MXCRE模型中Arid2的诱导缺陷与VAVCRE模型一致,添加T细胞的显着降低(CD3+)在PB(36%至24%)和SPL(30%至19%)和LSKCD150的显着降低+CD48+ (0.016%至0.007%)和LSKCD150CD48+ (0.13%至0.07%)BM中的细胞(图1e)。总体而言,ARID2的丧失导致轻度贫血,在成年小鼠中稳态血液血液血液血液成熟淋巴和祖母菌中减少。

      ARID2损失导致HSPC分化在造血再生中的损害

      为了检查ARID2 NULL HSC的再生功能,我们进行了非竞争性和竞争性移植实验。通过移植ARID2进行连续非竞争移植,直接移植术FL / FL. VavCre+ (ARID2 NULL,实验)或VAVCRE+ (对照)整个BM进入致命辐照的C57 / BL6受体小鼠。实验和控制供体小鼠是CD45.2+和受体小鼠是CD45.1的+ 老鼠。通过CD45.2的流式细胞仪分析评估嵌合性+ versus CD45.1+。在初级移植,整体重建,由CD45.2确定+ ARID2 NULL主收件人在20周的时间内的百分比在PB中大约80%,并且在ARID2空和控制收件人之间的挫折差异非常谦虚(90%至80%)(图2一种; 补充图E3A,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。 CD45.2中的BM或SPL没有显着差异+,成熟的t-和骨髓细胞(Mac1+Gr1+)除了适度但显着,BM中的B细胞倒塌(72%至65%)减少(图2一种)。此外,LSKCD150还有谦虚但重要的,减少+CD48+ (99%至94%)和LSKCD150CD48 (96%至87%)在BM(图2一种)。来自初级接受者的整个BM被连续地移植到条件中的次要和迭代中,进入三级接受者。在二级和叔移移,与对照相比,ARID2零接受者的总体PB嵌合性显着降低,与二次移植(95%至86周,第20周的74%至56%进一步扩大的差异每周20)(图2公元前; 补充图E3B,C)。在SPL中,分别存在显着降低或趋势,分别在次级(90%至82%)和第三次(82%至66%)移植中的整体斜切性降低,以及T细胞嵌合体的一致显着降低(88%至73%的中学,68%至43%的大专)(图2公元前)。我们没有观察到BM中的整体嵌合体或成熟细胞谱系的任何显着变化,在二级或第三 - 图2公元前)。在第三移植中,SPL中成熟的粒状逆变(85%至94%)显着增加,并且BM中CMP(86%至91%)的显着增加(图2C)。此外,LSKCD150的显着降低CD48 (73%至51%)在BM( 图2C)。
      图2
      图2评估VAVCRE模型中ARID2空HSPCS的再生潜力。 (A-C) VAVCRE系列非竞争移植。来自CD45.2的200万整个BM细胞 +vavcre.+ or Arid2FL / FL.vavcre.+ 将供体小鼠连续移植到致命辐照的CD45.1中+ 收件人。 CD45.2的频率+ PB 4-20周的细胞在终点(终点(20周)中的SPL和BM和BM和HSPC细胞室中的成熟细胞室(20周) (一种),中学 (b), 和第三个 (C) 收件人。 (d) VAVCRE竞争性移植. 来自CD45.2的一百万个整体BM细胞+vavcre.+ or Arid2FL / FL. VavCre+ 用CD45.1将供体小鼠混合1:1+ 竞争对手细胞并移植到致命辐照的CD45.1中+ 收件人。 CD45.2的频率+ PB 4-20周的细胞后移植,在终点(20周)的SPL和BM和HSPC细胞室中的成熟细胞室(20周)。 n =每种基因型3-5只小鼠。 *p value < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001,通过参数,双尾 t test.
      为了进一步检查ARID2对HSC功能的损失的影响,我们对ARID2 NULL BM进行了竞争性移植。来自Arid2的整个BM FL / FL. VavCre+ (ARID2 NULL,实验)或VAVCRE+ (对照)小鼠以CD45.1的全部BM混合在1:1的比例下+C57 / BL6小鼠并移植到CD45.1中+C57 / BL6小鼠。如图所示 图2D,ARID2零细胞具有减少的重新迁移电位,因为在20周的时间过程中,通过PB中总体斜倚的大致双重减小而反映了( 图2D; 补充图E3D.)。 SPL和BM中的B-和T细胞(〜杯)斜/旋际存在显着降低,以及SPL中的整体斜切性下降(图2d)。由于数据的大变化,BM在终点中,BM的整体逆向表现出降低趋势,这不是统计学意义的,因为数据的变化很大。 LSK嵌合体下降(68%至50%),LSKCD150的显着减少 CD48+ 细胞(64%至42%),而另一个HSPC和祖细胞群体没有表现出显着的变化(图2d)。这些数据在一起表明,与野生型细胞相比,ARID2的丧失导致HSCs的再生能力降低,导致分化为淋巴谱系的减少能力。
      要排除在ARID2空BM中的HSC再生功能受损的是,由于植入缺陷,我们使用诱导型造血特异性MX1驱动的CRE表达式(MXCRE)小鼠模型进行了竞争性和非竞争性移植[
      • velasco-hernandez t
      • SäwénP.
      • 布莱德D.
      • Cammenga J.
      MX1-CRE系统的潜在缺陷:对正常和恶性造血的实验建模的影响。
      ]。 ARID2由PIPC施用4周持近持续物(第0周),允许在切除前稳定植入。我们在PIPC后20周的过程中监测了PB挫折,并在终点处分析了SPL和BM中的斜切性。与VAVCRE模型相比,MXCRE模型中观察到的再生HSC函数受损的缺陷相似但加剧了。与VAVCRE模型中非竞争性连续移植的结果类似,我们观察到在PB中的ARID2 NULL和控制受体之间的嵌合性的显着降低(93%至81%)( 图3.一种; 补充图E4A,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。此外,SPL(92%至75%)和BM(84%至74%)的整体逆变中的整体斜切性显着降低,以及SPL中成熟的T-和B细胞倒眠(93%至83%在终点上分别为98%至95%)和BM(分别为85%至68%和78%至60%)(图3.一种)。此外,MXCRE模型显示HSPC群体-LSKCD150CD48+ (98%至96%),LSK(97%至93%),CMP(96%至88%)和MEP(55%至23%) - 明显减少(图3.一种)。在竞争性移植中,结果表明,VAVCRE模型中观察到的一致性:Pb在20周的时间过程中,PB总体斜切性的大约两倍降低,整体CD45.2的显着降低显着降低+ 斜切位学(50%至30%)和T细胞倒塌(45%至16%)Cell嵌合体在SPL中,T细胞显着降低(43%至24%)和B细胞(47%至27%)在BM中的斜切性,LSKCD150的显着减少CD48+ (82%至16%)在BM中(图3.B; 补充图E4B.)。与VAVCRE模型不同,整体CD45.2也有显着下降+ BM中的斜切性(65%至37%)和LSKCD150的显着减少+CD48+ (89%至27%),LSKCD150CD48 (77%至38%),MEP(52%)(52%至25%)BM倒塌(图3.b)。
      图3.
      图3.使用MXCRE模型的ARID2空HSPC的骨髓移植。 (一种) MXCRE初级非竞争性移植。持近4周(第0周),受体小鼠接受了PIPC注射。 CD45.2的频率+ PB 0-20周的细胞在终点(Endpoint(20周)的SPL和BM中的成熟细胞室,以及BM中的HSPC细胞室)。 (b) MXCRE竞争性移植。持近4周(第0周),受体小鼠接受了PIPC注射。 CD45.2的频率+ 在PB 0-20周的细胞后翻转,在终点(20周)的SPL和BM和BM和HSPC细胞室中的成熟细胞室(20周)。 n =每种基因型3-5只小鼠。 * p value < 0.05, **p < 0.01, ***p <参数0.001,双尾 t test.
      为了了解ARID2丧失的细胞效应,我们进行了细胞循环分析,用KI67和DAPI进行了细胞循环分析,凋亡分析,在MXCRE模型中竞争移植的竞争移植终点中,在HSPC群体中进行了凋亡分析。在稳定状态或竞争性移植期间,我们没有观察ARID2零与控制接受者的任何显着差异(补充图E5.,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。这些数据表明,ARID2丧失对HSPCs再生能力的影响不是由于细胞凋亡或细胞周期状态的变化。
      总而言之,这些数据表明ARID2的丧失损害了HSC的再生功能。与野生型HSC相比,ARID2 NULL HSCs的分化电位降低,而HSC自我更新相对不受干扰。这种降低的分化电位反映在具有淋巴潜力的降低和分化成熟淋巴结的能力下降。对Hspcs再生能力的影响不是由于这些细胞的植入潜力的损伤,如在VAVCRE和MXCRE模型中观察到的可比较表型所示。

       ARID2损失导致炎症途径的转录上调

      为了了解HSPC生物学中ARID2功能的分子机制,我们通过RNA测序从ARID2分离的LSK细胞中测序进行转录组分析FL / FL. MxCre+ (KO), or MxCre+ (对照,CTRL)小鼠6周后给药后6周。基因表达分析显示,使用绝对原影,2,021个基因在敲除(KO)LSKS与控制之间差异表达2 折叠变化阈值>1.5 and adjusted p value <0.05。在差异表达基因中,上调1,104,下调917(图4.A,B; 补充表E4,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。通过RNA测序确认EXON 4中mRNA中的ARID2切除(图4.C; 补充图E6A,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。 ARID2的总体正常化表达不变(调整 p 价值= 0.97)控制与条件敲除;非感觉介导的mRNA衰减可能没有发生(,B.)。我们使用先前描述的HSPC基因签名进行了表达数据的基因设定富集分析(GSEA)[
      • Pietras EM.
      • Reynaud D.
      • 康y-a
      • 等等。
      功能性不同的谱系偏置的多能祖祖管血液产生控制正常和再生条件。
      [发现在KO细胞中富集霉菌偏置的MPP签名(MPP3),而纯化淋巴偏置的MPP(MPP4)签异质富集在对照细胞中(图4.d)。此外,使用反应组数据库的GSEA揭示了KO细胞中的富集症,包括白细胞素(IL)-1和TLR样受体(TLR)信号传导途径和由MyD88和TRIF介导的信号级联,导致核因子κB(NFκB)激活(图5.一种)。实际上,这些途径内的大多数基因包括多次TLR,在KO细胞中上调,而IL-1受体被下调(补充数据E6D,EE7,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.)。此外,我们使用I-CIS靶标以识别显着的差异表达基因中的超人级转录因子基序,并发现NFκB,Rela和Rel(图5.B,C)在富集的主题中[
      • Herrmann C.
      • van de sande b
      • Potier D.
      • 艾尔特斯S.
      i-cistarget:一种用于预测监管特征和顺式调节模块的综合基因组学方法。
      ,
      • Imrichováh
      • Hulselmans G.
      • 卡莱德阿塔克斯Z.
      • Potier D.
      • 艾尔特斯S.
      I-Cistarget 2015更新:人类,老鼠和飞行中的广义式CIS-COMMICATICATION分析。
      ]。此外,富集NFκB靶基因和KO细胞中那些基因的显着上调(图5.d,e)[

      Gilmore实验室。 NF-KB靶基因。 NF-KB转录因子:波士顿大学生物学。可用于: http://www.bu.edu/nf-kb/gene-resources/target-genes/。访问了2020年11月22日。

      ]。在KO细胞中鉴定出SPIB,SPI1和SPIC的转录因子基序,以及积极调节的PU.1基因的富集和上调,在KO细胞中鉴定出来(图5.公元前; 补充图E6F,G)[
      • 庞舍
      • De Graf Ca.
      • 希尔顿德
      • 等等。
      PU.1是多能祖细胞对常见淋巴祖细胞的发育进展所必需的。
      ]。这与我们观察到的红细胞和淋巴结血管损伤一致,因为之前的研究表明,连续高的PU.1表达水平损害红细胞分化[
      • Schuetze S.
      • Stenberg Pe.
      • Kabat D.
      与ETS相关的转录因子PU.1永生化红细胞。
      ]以及B-和T细胞发展[
      • 德国人rp.
      • 辛格H.
      PU.15858
      ,
      • 安德森MK.
      • Weiss啊
      • Hernandez-Hoyos G
      • 迪涅CJ.
      • Rothenberg EV.
      胎儿造血祖细胞在Pro-T细胞阶段的T细胞发育中的组成型表达。
      ]。最后,我们调查了炎症信号传导的失调是否利于ARID2空细胞损伤的机制。为此,我们比较NFκB和MAPK信号转导,以及在IL-7和LPS(TLR4激动剂)的存在下的细胞增殖,对照和ARID2零细胞之间的刺激。我们检查了LPS刺激在林的宜家和P38磷酸化水平C-kit.+ 细胞。我们没有发现IKKβ的任何重大变化(补充图E8A,B,仅在线,可用 www.vertebradijital.com.),并且P38的结果不确定,因为在没有LPS的零时间点处的P38的高背景水平。尽管如此,我们的[3H]胸腺苷掺入法测定显示,与单独的IL-7存在的野生型对应物相比,ARID2零细胞的增殖显着降低。通过添加LPS进一步降低ARID2零细胞的细胞增殖,而LPS的引入对野生型细胞没有影响( 图5.F)。此外,LPS的这种效果是淋巴特异性,因为我们没有观察到ARID2零和控制细胞之间的粘蛋白菌落形成的任何差异(补充图E8B.)。鉴于这些炎症途径,一般来说,损害HSC自我更新[
      • Pietras EM.
      炎症:健康与疾病中造血干细胞命运的关键调节因子。
      ,
      • 刘阿
      • 王Y.
      • 丁Y.
      • Baez I.
      • Payne KJ.
      • Borghesi L.
      切削刃:造血干细胞膨胀和常见的淋巴祖母耗尽需要慢性内毒素模型中的造血衍生的细胞 - 自主TLR4。
      ,
      • Takizawa H.
      • 弗里奇K.
      • kovtonyuk lv.
      • 等等。
      病原体诱导的造血干细胞中的TLR4-TRIF先天实体免疫信号促进增殖,但减少了竞争性的健康。
      ,
      • Nagai Y.
      • 加勒特吉普
      • OHTA S.
      • 等等。
      造血祖细胞上的造成的Toll样受体刺激先天免疫系统补充。
      ,
      • esplin bl.
      • Shimazu T.
      • 威尔纳卢比
      • 等等。
      慢性暴露于TLR配体损伤造血干细胞。
      ]以促进髓鞘发育的牺牲促进骨髓分化[
      • Pietras EM.
      • mirantes-barbeito c
      • 福科
      • 等等。
      慢性白细胞介素-1暴露在自我更新的牺牲时将血液吞咽干细胞驱动到早熟的骨髓差异。
      [这些发现与我们在移植实验中观察到的淋巴呕吐能力的观察表型相一致。
      图4.
      图4.ARID2 NULL HSPC的转录组分析。 (一种) 差异表达基因的热图(调整 p <mxcre之间的0.05和折叠变化±1.5)+ (Ctrl) and Arid2FL / FL. MxCre+ (ko)LSKs Pipc注射后6周。 (b) KO和Ctrl之间的差异表达基因的火山曲线。 (C) 来自ARID2外显子4(顶部)的归一化RNA测序数据的代表性基因组轨迹和CTRL和KO(底部)的ARID2外显子4的总标准化读数。 (d) MPP基因特征的GSEA图
      [
      • Pietras EM.
      • Reynaud D.
      • 康y-a
      • 等等。
      功能性不同的谱系偏置的多能祖祖管血液产生控制正常和再生条件。
      ]
      Ko和Ctrl之间。 n =每个基因型的3个凋落物匹配的小鼠。
      图5.
      图5.ARID2空HSPC中转录组织数据的路径分析。 (一种) 来自MXCRE中的反应途径数据库的显着上调途径+ (Ctrl) or Arid2FL / FL. MxCre+ (ko)LSKs Pipc注射后6周。炎症途径被突出显示 红色的. (b) 富含NFκB转录因子基序(顶部),顶部显着富集的转录因子基序特征,其在显着的差异表达基因内鉴定的I-cistarget在KO与Ctrl LSK细胞(底部)中鉴定的正常化富集评分(NES)[
      • Herrmann C.
      • van de sande b
      • Potier D.
      • 艾尔特斯S.
      i-cistarget:一种用于预测监管特征和顺式调节模块的综合基因组学方法。
      ,
      • Imrichováh
      • Hulselmans G.
      • 卡莱德阿塔克斯Z.
      • Potier D.
      • 艾尔特斯S.
      I-Cistarget 2015更新:人类,老鼠和飞行中的广义式CIS-COMMICATICATION分析。
      ]。 (C) 对应于KO和CTRL LSK细胞I-CIS靶标鉴定的基序的转录因子基因的热图。 (d) KO和Ctrl之间的NFκB靶基因的GSEA富集图
      [

      Gilmore实验室。 NF-KB靶基因。 NF-KB转录因子:波士顿大学生物学。可用于: http://www.bu.edu/nf-kb/gene-resources/target-genes/。访问了2020年11月22日。

      ]
      . (e) 在CTRL或KO LSK中的显着差异表达NFκB靶基因的热图。 n =每个基因型的3个凋落物匹配的小鼠。 (F) [3H]胸腺苷掺入:7.5×104 来自MXCRE的整个BM细胞+ 和 Arid2FL / FL. MxCre+ 非竞争初级移植的受体小鼠在IL-7(10ng / ml)中单独培养,或单独培养6天,然后脉冲[3H]胸苷18小时。非竞争性原发性移植受体小鼠接受过4周的PIPC注射4周。 n =每种基因型6只小鼠。 *p < 0.05, **p <0.01,通过参数,双尾 t test.

      讨论

      SWI / SNF组分在血液缺血中具有广泛的作用,并且在各种恶性肿瘤中的肿瘤抑制剂的作用[
      • 威尔逊BG.
      • 罗伯茨CWM.
      SWI / SNF核心重塑者和癌症。
      ,
      • sh a
      • Pollack Jr.
      SWI / SNF突变的光谱,人类癌症中普遍存在。
      ,
      • Buscarlet M.
      • Krasteva V.
      • HO L.
      • 等等。
      BRG的基本作用,BAF染色质重塑复合物的ATPase亚基,白血病维持。
      ]。在这里,我们使用造血特异性小鼠模型来了解ARID2,PBAF独特亚基的作用,在正常的血液血液和HSPC功能中。我们的研究发现,ARID2的丧失导致轻度贫血和成年小鼠成熟B和T细胞的降低(图1d,e)。通过移植检查的造血应激,ARID2空BM表现出损害,细胞 - 自主再生潜力,如连续非竞争移植中的PB斜切性降低所证明的(图2; 补充图E3),以及竞争重建中的逆转烟道中的双重减少(图3.; 补充图E4)。此外,我们确实观察了非竞争力的各种HPC斜切位中的降低(图2)和竞争力(图3.)移植。第三次非竞争性移植揭示了骨髓偏向血液缺陷的证据:在SPL和BM中CMP中的CMP中增加的MAC1 / GR1逆转体增加(图2C)。在一起,这些数据表明HSC分化对ARID2的丧失受到损害。分化损伤在很大程度上归因于LSK CD48 +,淋巴限制,祖细胞群体的减少。与此一致,在移植实验中观察到的成熟细胞的变化在B型和T细胞室(图2.3; 补充图E3和E4)。 VAVCRE和MXCRE模型之间的类似观察表明,ARID2 NULL和控件之间观察到的差异不是由于ARID2空细胞的植入缺陷(图2.D和 3b)。在这项研究期间,Liu等人。 [
      • 刘L.
      • WAN X.
      • 周P.
      • 等等。
      染色质改造亚基BAF200促进正常血液血液,抑制白血病。
      [使用ARID2敲除小鼠模型公布了它们对造血表型的表征。我们的数据同意其调查结果,所述两组在竞争性移植过程中观察到稳态血液血液血症中的贫血,并降低了ARID2空HSPCS的分化能力。然而,与他们的数据相比,我们没有观察到稳态的VAVCRE模型中的降低的HSC频率。此外,我们的研究通过连续的非竞争移植评估了HSC自我更新,并且显示至少除了第三级移植,自我更新仍然是相对完整的,如LSK CD48中的类似逆变所证明CD150+ 在ARID2 NULL和控制单元之间。刘等。没有在发表的研究中处理HSC自我更新。
      我们进行了批量RNA测序以了解ARID2空HSPC损伤的基础。我们的RNA测序分析确定了一些但不是全部,在刘等人中突出的ARID2空HSPC和控制之间的差异表达基因。的研究[
      • 刘L.
      • WAN X.
      • 周P.
      • 等等。
      染色质改造亚基BAF200促进正常血液血液,抑制白血病。
      ]通过RT-QPCR。我们无法在全球范围内比较我们的转录组分析与他们的差异的程度,因为刘等人。不使用复制,因为差异基因表达的统计分析所必需的。我们的RNA测序数据另外,在ARID2敲除细胞中鉴定了霉菌偏置MPP签名(MPP3)的富集,但不是淋巴偏置的MPP(MPP4)签名。该结果与观察到的血浆潜力和重构移植中成熟淋巴细胞的降低一致。同样,我们鉴定了炎症途径,包括多种TLR途径,是ARID2敲除细胞中最受影响的多种途径。此外,我们表明,通过LPS,TLR4激动剂的刺激功能危及淋巴细胞促进条件下的ARID2零细胞增殖。炎性途径的上调为我们观察到的淋巴表型提供了可能的解释,因为已经显示TLR途径的激活导致类似的表型[
      • Pietras EM.
      炎症:健康与疾病中造血干细胞命运的关键调节因子。
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      • 刘阿
      • 王Y.
      • 丁Y.
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      • 福科
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      慢性白细胞介素-1暴露在自我更新的牺牲时将血液吞咽干细胞驱动到早熟的骨髓差异。
      [我们在我们的ARID2淘汰模型中观察到,即HSPCS的再生能力受损,尤其是淋巴结谱系。此外,PU.1的上调也可能有助于我们观察到的表型。需要进一步的研究来验证炎症途径和升高的PU.1表达在介导ARID2敲除表型中的功能重要性,以及ARID2是否通过转录调节直接调节这些途径。

      利益冲突披露

      作者声明没有竞争利益。

      致谢

      作者感谢Benedetta Bonacci的援助,以便于细胞排序。这项工作得到了来自美国癌症协会和威斯康星州癌症中心医学院的制度研究授予的第16-183-31号机构研究所的支持。

      附录。 补充材料

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