广告

CLL样单克隆B细胞淋巴细胞增多症显示出增加的炎症信号,在早期慢性淋巴细胞性白血病中有所减轻

开放存取发布时间:2021年1月6日DOI://doi.org/10.1016/j.exphem.2020.12.007

      强调

      • MBL中主要由单核细胞介导的炎症信号增强
      • 在早期CLL中,尤其是IGHV突变后,这种炎性信号减少了
      • Th1和细胞毒性CD4的相似增加+ 在两个实体中都检测到T细胞
      • 在两个实体中相似地观察到单核细胞的肿瘤支持作用

      抽象

      多项研究表明,慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的免疫细胞功能受损,有助于逃避肿瘤和疾病进展。然而,在CLL样单克隆B细胞淋巴细胞增多(MBL)研究中很少。本文中,我们表征了62名临床MBL患者,56名早期CLL患者和31名健康对照组的免疫环境。对来自CD4的RNA进行基因表达阵列和qRT-PCR+外周血细胞通过免疫测定法测定血清细胞因子;和HLA-DR在循环单核细胞以及Th1,细胞毒性,精疲力竭和效应CD4上的表达+通过流式细胞术表征T细胞。此外,进行了克隆B细胞和CD14富集或耗尽的细胞部分的细胞培养。令人惊讶的是,MBL和早期CLL的促炎特征不同。在MBL中鉴定到主要由单核细胞精心安排的炎症驱动增加,表现出增强的吞噬作用,模式识别受体,IL8,HMGB1和急性反应信号通路,并增加了促炎细胞因子(特别是IL8,IFNγ和TNFα)。与MBL相比,在早期CLL(IL8和IFNγ水平降低,IL8信号通路和单核细胞HLA-DR表达降低)中,这种炎症信号减弱了,特别是在那些具有IGHV基因突变的患者中。另外,CD4+MBL和早期CLL的T细胞显示类似的Th1和细胞毒性基因上调,并扩展了CXCR3+和穿孔素+CD4+T细胞和PD1+CD4+T细胞与对照相比。细胞培养测定揭示了在MBL和早期CLL中类似地观察到的单核细胞的肿瘤支持作用。这些新发现揭示了MBL和CLL之间在炎症环境方面的差异,突显了在疾病的早期阶段抗原刺激的积极作用,这可能与恶性B细胞转化有关。

      GRAPHICAL 抽象

      介绍

      慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的T细胞中已描述了几种改变,可能是长期暴露于肿瘤细胞的结果[1-8]。另外,在该疾病患者的外周血(PB)中检测到单核细胞数量增加,显示出与吞噬作用和炎症有关的失调基因[9]。血清细胞因子水平在CLL中也有改变[10],某些细胞因子如CCL3或IL8水平升高与预后较差有关[11,12]。
      CLL样单克隆B细胞淋巴细胞增多症(MBL)定义为PB中存在B克隆克隆群(<5 × 109/ l)具有与CLL一致的表型,而没有该疾病的其他临床特征。它的频率随着年龄的增长而增加,存在于>90岁以上的人中有50%。那些克隆B细胞计数的病例>0.5 × 109/ l被称为临床MBL,被认为是恶性前病。他们显示需要治疗的CLL进展率为1-2%/年。实际上,几乎所有CLL案例都在MBL阶段之前[13-17]。
      The role of immune interactions in MBL remains uncharacterized. While B cell expansions in patients with advanced CLL are accompanied by immune SUPpression that restrains antitumor immunity, prior investigations have shown that T cell function in MBL is only slightly deviated [1, 18]. Thus, although immunosuppressive features 和 T cell repertoire restrictions are already detectable in MBL 和 evolve toward a 更多 SUPpressive profile across the disease stages [18-20], the functional immune cell fraction may play relevant roles in MBL dynamics 和 in clonal evolution leading to CLL. Understanding immune interactions in pre-leukemic individuals would also be relevant for deciphering molecular mechanisms underlying the natural history of the disease. In this study, we characterized PB CD4+ 细胞(包括CD4+ T细胞和单核细胞)和一大批MBL和早期CLL患者的血清样本,以更全面地阐明这些问题。

      材料与方法

       患者和样本

      共有62名临床CLL样MBL患者和56名未经治疗的早期CLL患者(Binet A / Rai 0-I和<20 × 109 评价克隆的B细胞/ l)。在巴塞罗那(西班牙)的德尔玛医院(n = 50)和瓦尔·德希伯伦医院(n = 11)和纽约(美国)的诺斯韦尔健康中心(n = 57)对患者进行护理。另外,研究了31名年龄匹配的健康受试者作为对照。抽样时无病例有感染迹象。整个队列的主要特征总结如下 表格1。在研究结束时,所有MBL病例均无症状,没有进展为需要治疗的CLL。这项研究是根据国家和国际准则(《专业行为守则》,《赫尔辛基宣言》)进行的,并得到巴塞罗那德尔马医院伦理委员会的批准(2011/4317 / I)。新鲜的PB,冷冻保存的PB单核细胞(PBMC)和冷冻的血清样品通过几种方法进行了表征(补充图1)。部分样品来自MARBiobanc(巴塞罗那)。使用REDCap收集了Northwell Health的数据[21]。
      表格1分析和最后随访时研究队列的特征。
      控制(n = 31)MBL(n = 62)CLL Binet A(n = 56)
      年龄64(42-88)69(45-89)64(37-89)
      绝对淋巴细胞计数(x109 细胞/升)1.7(0.4-3.2)5.0(0.9-10.1)13.2(7.9-24.2)
      克隆B细胞计数(x109 细胞/升)不适用*2.1(0.5-4.8)10.2(5.8-19.4)
      莱舞台不适用不适用
      048(85.7%)
      I8(14.3%)
      突变的IGHV不适用48/54(88.9%)32/54(59.3%)
      治疗患者不适用011(19.6%)
      死亡人数不适用3(4.8%)6(10.7%)
      招聘后续工作(月)不适用48(0-117)67(0-143)
      值以中位数(范围)或数字(%)给出。不适用:不适用。 *多克隆B细胞计数:0.07×109 细胞/ l(0.04-0.21)。

       细胞分离和RNA提取用于基因表达分析

      将新鲜的PB进行Ficoll密度梯度离心。纯化的CD4+CD19 (总CD4+ 细胞,包括CD4+ T细胞和单核细胞),CD4+CD14 (CD4+ T细胞)和CD14+ 基于阳性选择方法,采用免疫磁珠(CD19 Multisort Kit,CD19 MicroBeads,CD4 MicroBeads和CD14 MicroBeads)和autoMACS技术(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,德国)从PBMC中分离细胞(单核细胞)。补充图2显示了流程图,该流程图描述了用于基因表达分析的所有细胞分离程序。为评估纯化过程的功效,使用抗CD3(APC),抗CD4(PE)通过流式细胞术分析了每个样品的100000个细胞),抗CD14(FITC)和/或抗CD45(PerCP-Cy5.5)抗体(BD Biosciences,美国加利福尼亚州圣何塞)。除两个MBL受试者的总CD4纯度外,所有样品的纯度均达到≥90%+ 细胞为70%。将纯化的细胞在-80°C下储存在1%BME RLT-plus缓冲液(QIAGEN,芬洛,荷兰)中。最终按照RNeasy Plus Mini Kit方案(QIAGEN)提取RNA。

       基因表达谱分析

      总CD4中的RNA+ 在9例健康对照组,15例MBL和14例CLL病例中,将细胞用于基因表达阵列。用于微阵列实验的所有样品均具有RNA完整性数(RIN)>7.简要地说,将30 ng的总RNA逆转录成cDNA并扩增(美国加利福尼亚州红木城的NUGEN公司的Pico WTA System V2 V2)。纯化cDNA产物(MinElute Reaction Cleanup Kit,QIAGEN),测量产量和纯度,然后将生物素化的片段添加到杂交混合物中,最后按照制造商的规定在GeneChip Human Gene 2.0 ST阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)上杂交说明。使用Expression Console(Affymetrix)和R(v3.1.1)进行数据质量评估。 aroma.affymetrix软件包中包含的稳健多阵列平均值(RMA)算法用于数据归一化[22]。为了纠正批处理效果,采用了在R包SVA中实现的ComBat [23]。差异表达分析使用 limma R包[24]。 P-值s <0.05和倍数变化| FC |>使用1.2截断值生成差异表达基因的列表。基因注释是从Affymetrix注释文件Human Gene 2.0 ST array(NetAffix版本na34,hg19)获得的。使用UCSC数据库(2009年2月,hg19,GRCh37)来补充Affymetrix注释。微阵列数据已以序列号GSE125791存放在基因表达综合(GEO)数据库中[25]。总CD4遗传标记的基因途径分析+ 细胞使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA,QIAGEN)完成。最后,要了解单核细胞和T细胞在基因表达中的不同作用,可以使用BioGPS工具(http://biogps.org) 被雇佣。

       通过定量RT-PCR(qRT-PCR)进行基因表达分析

      确认微阵列在总CD4中检测到的基因表达水平+ 细胞,来自相同样品的RNA(不包括两种纯度的样品<90%的患者)以及来自8名MBL和5名CLL受试者(纯度≥90%,共49例)的另一个独立队列进行了qRT-PCR验证。阐明CD4的不同贡献+ T细胞和单核细胞的基因表达,其他CD14耗尽的CD4中的RNA+ 细胞(CD4+ T细胞)和CD14+ 对细胞(单核细胞)进行相同的qRT-PCR验证(分别在4名健康的和8 MBL的人以及3名健康的和9 MBL的人中)。该小组由13个选定的基因组成(CCL2,CLU,CXCL5,DEFA1,FGFBP2,GZMH,ITGAM,NEXN,NKG7,PPBP,RAB31,TUBB1VSTM1;补充表1)中详述的检测方法被基因表达阵列显着上调,并且与炎症,Th1细胞和细胞毒性途径有关。 通用USBGAPDH 被用作管家基因。根据生产商的说明,使用Taqman低密度阵列(TLDA,Life Technologies,Foster City,CA)在此定制的基因组中分析了总共400 ng的RNA。对于qRT-PCR数据分析,由SD定义的异常值重复>0.5和qRT-PCR阈值周期(Ct)>40,被排除在外。比较了ΔCt量度,定义为所研究基因的表达平均值减去所选管家基因的表达平均值。

       流式细胞仪分析

      评估了来自8位对照,11位MBL和10位CLL受试者的冷冻保存的PBMC。洗涤PBMC并用以下抗体标记:抗CD45(PerCP-Cy5.5),抗CD14(FITC),抗CD3(V450),抗CD4(PE),抗CD4(APC),抗-HLA-DR(PE-Cy7),抗CXCR3(PerCP-Cy5.5),抗穿孔素(AF488),抗颗粒酶B(FITC),抗PD1(PE)和抗CD27(PE)。 FVS510用于区分存活细胞和非存活细胞,并使用固定/通透溶液试剂盒对细胞内分子进行染色。同型对照(PE,PerCP-Cy5.5,PE-Cy7和APC)和荧光减一对照用于正确评估抗原表达。所有试剂均购自BD Biosciences。数据采集​​是在BD FACSCanto II细胞仪中进行的,并使用FACSDiva软件(BD Biosciences)进行分析。定义单核细胞和CD4的门控策略+ T细胞和评估目的抗原的表达详见 图1.
      FVS510 用于选择活细胞(1)。门控单线(2)后,CD45+CD14+CD4+ 选择细胞(单核细胞)(3和4),并记录HLA-DR的线性平均荧光强度(MFI)值(5a)。使用同种型对照(5b)确认了PE-Cy7在单核细胞上不存在荧光。另一方面,CD3+CD4+ 细胞(CD4+ T细胞被门控(6)。 CD4的百分比+ 使用同型对照(7b)评估了CXCR3(7a)和PD1阳性或CD27阴性的T细胞(7b),而CD4的百分比+ 使用荧光减一(FMO)对照(8b)评估穿孔素(8a)和颗粒酶B阳性的T细胞。在图中,荧光强度值转换为对数刻度。

       多重细胞因子分析

      在24名健康受试者,40例MBL和44例CLL病例中,对以下20种细胞因子的血清水平进行了定量:IL1β,IL2,IL4,IL5,IL6,IL8,IL10,IL12,IL15,IL17A,IFNα,IFNγ,TNFα,GM-使用U-PLEX平台(Meso Scale Discovery,Rockville,MD,USA)的CSF,CCL3,CCL4,CCL19,CXCL10和CXCL11和使用人CXCL9 / MIG Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems,美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。所有测定均一式两份进行,浓度以皮克/毫升报告。为了研究潜在的细胞因子相互作用,获得了它们各自的编码基因,并使用IPA分析了基因组数据。

       肿瘤细胞存活率分析

      使用了来自6名MBL受试者和5名CLL患者的冷冻保存的PBMC,这些患者均具有突变的IGHV基因。基于阴性选择方法,采用免疫磁珠(B-CLL细胞分离试剂盒)和autoMACS技术(Miltenyi Biotec)分离纯化的肿瘤B细胞。为了评估纯化过程的功效,使用抗CD33(FITC),抗CD4(PE),抗CD20(PerCP-Cy5.5)和抗CD5(APC)抗体通过流式细胞术分析了每个样品的100000个细胞(BD Biosciences)。所有样品的肿瘤B细胞纯度均≥90%(中位数:98.2%,范围:90.1-99.2)。此外,使用CD14 MicroBeads(Miltenyi Biotec)获得了富含CD14的细胞级分和缺少CD14的PBMC。相同的流式细胞仪用于评估富含CD14的细胞部分(中位数:85.9%,范围:51.3-95.3),总PBMC和CD14耗尽的PBMC中单核细胞的百分比(中位数:分别为4.7和0.9%, P-值=0.003). A total of 1 × 105 单独或在6×10存在下培养肿瘤细胞5 CD1富集级分的细胞,除了1×10的细胞培养6 total PBMCs 和 CD14-depleted PBMCs. Cells were resuspended in 200 µl of RPMI 1640 medium SUPplemented with 1% Fetal Bovine Serum (FBS), L-glutamine (4 mM), penicillin (100 U/ml) 和 streptomycin (100 µg/ml) in MW96 assay plates (Corning Inc., Corning, NY). Cells were then centrifuged at 200 x g for 4 minutes 和 cultured for 24 hours at 37°C 和 5% CO2。在此期间之后,将细胞洗涤并用抗CD33(FITC),抗CD4(PE),抗CD20(PerCP-Cy5.5),抗CD5(APC)和FVS510进行标记,从而可以鉴定出两种如图3所示。在所有纳入的患者中,肿瘤细胞克隆中的亚群(活细胞和非活细胞)都在BD FACSCanto II细胞仪中进行了数据采集,并使用FlowJo(FlowJo LLC,Ashland,OR)进行了分析。通过用富含CD14的细胞部分培养的肿瘤细胞的生存能力减去单独培养的肿瘤细胞的生存能力之间的差来评估单核细胞对肿瘤生存力的影响。

       统计分析

      使用t检验和Mann-Whitney U检验来估计独立组之间差异的统计学显着性,而使用Wilcoxon检验评估比较同一受试者不同状况的肿瘤细胞生存分析结果。计算线性回归分析和Spearman相关性,以通过流式细胞术评估基因表达强度和蛋白质表达之间的关系。 P-值s <0.05被认为是显着的。使用R,SPSS v.22和SAS v9.3进行统计分析。

      结果

       MBL中炎症信号增强,主要由单核细胞导致

      通过总CD4中的基因表达阵列鉴定的谱+ 在MBL和对照之间比较单核细胞。仅考虑纯度≥90%的病例,MBL中总共有1786个基因差异表达(953个过表达和833个过表达)。差异最大的基因在补充表2中进行了详细说明。qRT-PCR分析证实了11/13基因检测中的显着过表达(85%),当仅考虑IGHV突变的MBL受试者时,这种表达得以维持(补充表1)。
      总CD4中观察到的遗传特征的基因途径分析+ 使用IPA对来自MBL个体的细胞进行了识别,IPA识别了MBL与对照之间的1330个差异表达的基因。预计将被激活的重要经典途径(Z评分≥2)包括几种通常涉及单核细胞和巨噬细胞的功能,例如Fcγ受体介导的吞噬作用,模式识别受体(PRR)在病原体识别中的作用,急性期反应或TREM1信号通路。炎症小体,趋化因子和IL8信号通路也预计会被激活(图2, Supplementary Tables 3 和 4). As expected, BioGPS analysis SUPported a myeloid contribution for the differentially expressed genes of these pathways (Supplementary Table 5). These results were maintained when only IGHV mutated MBL individuals were taken into account (Supplementary Table 4).
      图2
      图2总CD4中差异表达的基因和途径+ MBL和CLL患者的细胞。
      此外,上游分析还预测了一些编码病原体识别的受体和共受体的基因(TLR2,TLR7 / 8 要么 CD14)和促炎细胞因子(IFNG,TNF,IL1B,IL17A 要么 IL18)激活(补充表6)。与细胞迁移和炎症有关的许多功能也被预测会被激活(补充表7)。
      基因表达强度表示为log2 值居中并按比例缩放。补充表3提供了所列举基因的详细信息。 PRR:模式识别受体; APR:急性期反应; S .:信令。
      This increased inflammatory drive detected in MBL was also SUPported by serum cytokine analysis, which showed that levels of 11/20 measured cytokines (IL5, IL6, IL8, IL10, 干扰素γ, 肿瘤坏死因子, CCL3, CCL4, CXCL9, CXCL10 和 CXCL11) were significantly higher in MBL compared to controls (表2)。值得注意的是,其中5种(IL5,IL6,IL8,IFNγ和TNFα)参与HMGB1信号传导途径,该途径诱导促炎性细胞因子的释放,并被IPA激活(P-值<0.001,Z评分:2.2)。符合上述要求,上游分析预测Toll样受体(TLR)如 TLR3,TLR4TLR9 (P-值<0.001,Z分数:分别为2.4、2.4和2),可以通过HMGB1相互作用来刺激。值得注意的是,当我们重复考虑IGHV突变状态的分析(补充表8)时,与对照组相比,在具有突变和未突变IGHV基因的MBL受试者中,公开的10和4种细胞因子水平显着增加。少数具有未突变IGHV基因的MBL病例(n = 4)可能解释了这一组减少的显着差异,实际上这显示了与IGHV突变MBL中显着增加的那些细胞因子非常相似的高水平。因此,两个MBL组之间没有发现显着差异。
      表2健康对照,MBL受试者和CLL患者的血清细胞因子水平。
      细胞因子控制(n = 24)MBL(n = 40)CLL(n = 44)P-值
      中位数范围中位数范围中位数范围MBL与控制CLL与控制CLL与MBL
      IL1β0.260.07-5.850.350.07-124.270.470.07-114.130.4750.0610.219
      IL21.490.44-8.071.490.44-11.801.660.44-16.490.6330.2730.483
      IL40.210.06-0.790.210.06-40.670.080.06-1.340.8750.2700.210
      IL51.440.45-4.972.010.52-4.421.510.45-4.190.0040.5580.005
      IL62.041.16-151.093.621.16-1431.632.800.34-1689.050.0210.0800.495
      IL822.056.15-5216.03238.017.21-6810.2220.734.00-8807.270.0050.9800.019
      IL100.740.39-1.660.930.39-3.740.880.39-5.030.0170.1790.451
      IL121.070.60-3.571.070.60-18.421.070.60-3.080.2990.3580.824
      IL153.211.03-7.652.920.51-7.092.880.51-7.920.7870.7870.865
      IL17A2.510.51-13.142.520.51-21.392.520.51-16.690.1990.1960.895
      干扰素1.230.45-6.581.980.45-7.952.200.45-14.910.2860.3060.913
      干扰素γ11.243.30-42.0816.691.44-151.1413.243.30-69.330.0140.5770.026
      肿瘤坏死因子2.250.50-29.744.991.30-69.193.300.70-28.210.0150.1400.149
      通用脑脊液0.230.09-1.050.420.09-1.510.240.09-0.880.1510.3050.590
      CCL322.6717.80-2925.3046.0019.05-2913.3739.134.61-6427.700.0010.0700.395
      CCL4114.5356.66-1753.44176.5776.92-2358.09151.6129.75-2915.750.0120.1140.275
      CCL19109.3652.26-449.53131.953.17-871.66108.354.53-1561.500.0710.9080.078
      CXCL970.9815.70-1044.45165.5315.70-1166.00151.7815.70-1982.500.0030.0010.964
      CXCL10188.10102.88-985.02325.2110.73-1904.78230.795.25-735.040.0160.5810.029
      CXCL1132.3713.15-122.4047.0510.60-213.1053.698.09-315.390.0100.0380.844
      所有测定一式两份进行。细胞因子值以皮克/毫升(pg / ml)表示。重大 P-值s (<0.05)以粗体突出显示。

       在早期CLL中,MBL的炎症驱动降低,尤其是IGHV突变

      接下来,总CD4的基因表达谱+ 在CLL与对照以及CLL与MBL之间比较了单个核细胞(纯度≥90%)。总之,在CLL与对照比较中差异表达了1039个基因(460个过表达和579个表达不足),而在CLL与MBL中则有806个表达(398个过表达和408个过表达)。补充表2中详细列出了差异最大的基因。qRT-PCR分析证实了6种基因测定中的显着差异表达(补充表1)。
      IPA识别742个CLL与对照相比差异表达的基因;但是,未检测到明显的激活的规范途径。预测了一些功能性免疫的迹象(例如 CD28 补充表9),尽管与MBL相比对照的程度要小得多。血清中的细胞因子分析也证实了早期CLL炎症的减轻,该结果仅显示20种被测细胞因子中的2种(CXCL9和CXCL11)与对照相比,CLL的升高明显更多(表2)。
      关于CLL与MBL,IPA识别了598个差异表达的基因,这些基因显示磷脂酶和IL8信号通路与MBL相比,CLL显着降低(图2,补充表3和4),除了上游抑制 IFNG,IL5,TNF 要么 TLR7 与细胞迁移和脂质代谢有关的功能下降(补充表10)。当通过流式细胞术分析HLA-DR表达时,在循环单核细胞中特别证实了在早期CLL中与MBL相比观察到的免疫活性降低。因此,无论是考虑所有患者还是将分析仅限于IGHV突变患者,与MBL相比,CLL的单核细胞HLA-DR表达均显着降低(图3A,补充图4,补充表11)。最后,与MBL相比,CLL的4种细胞因子(IL5,IL8,IFNγ和CXCL10)的血清水平显着降低(表2)。
      在单核细胞(A)和CD4的百分比(%)上评估HLA-DR的MFI+ 登记了对CXCR3(B),穿孔素(C),颗粒酶B(D),PD1(E)阳性或对CD27(F)阴性的T细胞。重大 P-值s are indicated with * (<0.05), ** (<0.01) 要么 *** (<0.001)。点击率:健康对照。
      有趣的是,当根据IGHV突变状态将CLL病例分为两组时,MBL与IGHV突变的CLL患者之间的差异得到了强调(M-CLL,<98%种系身份)。从这个意义上讲,与MBL相比,M-CLL病例显示IL4,IL5,IL8,IFNγ,CCL3和CXCL10的水平降低。值得注意的是,这些细胞因子中的4种(IL4,IL5,IL8和IFNγ)参与了促炎性HMGB1途径,与MBL相比,预计在M-CLL中会受到抑制(P-值<0.001,Z评分:-2)。但是,与MBL相比,IGHV未突变(U-CLL,种系同一性≥98%)的CLL患者仅显示IL5和CCL19的水平显着降低,而IL1β的水平显着升高(图4)。由于具有IGHV基因突变和未突变的MBL受试者之间上述细胞因子水平相似,因此当考虑MBL的IGHV突变状态时,与CLL组的比较没有显着差异,并且在某些比较中统计学意义的丧失可能归因于更多两个MBL组的病例数均减少(补充表8)。
      图4
      图4突变IGHV(M-CLL)或未突变IGHV(U-CLL)的MBL和CLL患者的血清细胞因子水平。
      所有测定一式两份进行。 y轴上表示的细胞因子值(pg / ml)转换为对数标度。仅显示在至少一项比较中具有显着差异的那些细胞因子。重大 P-值s are indicated with * (<0.05) 要么 ** (<0.01).

       Th1和细胞毒性CD4的增加相似+ MBL和早期CLL中的T细胞

      对各组之间差异表达基因的详细分析还揭示了以前与Th1细胞相关的基因的上调[26](DUSP2,MAP3K8,PLEK,CFH,TARP,IL18RAP,GNLY,GZMH 要么 NKG7),总计CD4+ 与对照相比,MBL和CLL的细胞都没有。此外,与细胞毒性途径有关的基因(吉宝,GZMH,GNLY,FGFBP2,FCRL6 要么 NKG7与对照相比,两个实体中的)也被上调(图2,补充表3)。如果两个MBL病例的CD4总和+ 认为细胞纯度为70%, PRF1 (穿孔素编码)在MBL与对照(FC = 1.64)和CLL与对照(FC = 1.55)中也显着过表达。 BioGPS分析指出,与Th1细胞和细胞毒性有关的大多数差异表达基因均由T细胞贡献,后者仅显示CD8的统计学差异+ T细胞(补充表5)。考虑到细胞毒性CD4,这不足为奇+ T细胞与CD8密切相关+ T细胞。但是,当我们分析CD14耗尽的CD4中的RNA时+ 细胞(CD4+ T细胞)和CD14+ 使用先前描述的qRT-PCR面板对MBL受试者的单核细胞(单核细胞)进行了细胞毒性基因的显着过表达(GZMH,FGFBP2NKG7)仅在CD4上观察到+ T细胞(补充表12),可确认CD4+ T细胞占MBL中细胞毒性基因表达的特征。
      流式细胞仪分析验证了Th1和细胞毒性CD4的相似增加+ 两个实体中的T细胞。 CD4的百分比+ 与对照组相比,MBL和CLL受试者中CXCR3阳性的T细胞(通常被认为是Th1细胞的标志物)[27-28],穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性蛋白更高。此外,PD1的百分比增加+ (已用尽)或CD27 (效果器)CD4+ 在两个实体中也检测到T细胞。尽管如此,只有穿孔素(MBL vs.对照)以及CXCR3和PD1(MBL和CLL vs.对照)才达到统计学显着性,只有在考虑IGHV突变的患者时才保持统计学意义(图3B-F,补充表11)。
      对于那些通过基因表达阵列和流式细胞仪评估的病例(n = 13),观察到之间显着正相关。 PRF1吉宝 表达和CD4的百分比+ 穿孔素阳性的T细胞(ρ=0.62, P- 值= 0.024)和颗粒酶B(ρ=0.81, P- 值= 0.001)。

       在MBL和早期CLL中类似地观察到单核细胞的肿瘤支持作用

      为了了解单核细胞基因表达签名对肿瘤存活的可能功能后果,进行了不同的细胞培养。 24小时后,MBL和CLL受试者的存活肿瘤细胞百分比相似(中位数分别为64.6和68%, P-值=0.931) 和 also a similar effect of monocytes on tumor viability (median increase: 10.1 vs. 9.7% respectively, P-值=0.537). Relating to the aforementioned finding, viability of tumor cells from MBL subjects was increased when they were cultured in the presence of the CD14-enriched cell fraction (median: 64.6 vs. 79.3%, P-值=0.046) 和 similar results were observed for CLL (median: 68 vs. 83.9%, P-值=0.043). In line with this, CD14+ PBMC的细胞耗竭导致CLL中肿瘤细胞活力下降(中位数:88.7对71.6%, P-值=0.043) 和 a similar trend was observed in MBL (median: 85.8 vs. 75.6%, P-值=0.075) (图5)。
      将所有细胞培养物孵育24小时。为了评估肿瘤细胞的生存力,单独培养克隆性B细胞(A)。通过用富含CD14的细胞培养的肿瘤细胞的活力减去单独培养的肿瘤细胞的活力来评估单核细胞对肿瘤活力的影响(B)。对于每个受试者,显示了两个先前状况之间的肿瘤生存力的变化(C),以及总PBMC或CD14消耗的PBMC中肿瘤细胞的生存力(D)。

      讨论区

      CLL的一些研究报告了功能失调的微环境,具有肿瘤支持作用[4-9,29,30]。在本研究中,在MBL中发现了免疫刺激的迹象,MBL表现出通过不同技术证实的炎症信号增强。值得注意的是,先前的研究主要集中在疾病的更晚期,其中独立的恶性增殖伴随着严重的免疫抑制。缺乏全面表征MBL免疫系统(包括单核细胞的分子途径)的先前研究,可能解释了为什么尚未揭示这种早期炎症特征的原因。
      值得注意的是,MBL显示出与先天免疫细胞(例如单核细胞)识别病原体有关的几种功能的激活。其中,突出了吞噬作用和对TRR等PRR的刺激,这会触发促炎基因的过度表达[31]。同样,HMGB1也发挥了作用,它可以与PRR结合以介导细胞因子的产生[32]。在这些细胞因子中,IL8被释放并充当免疫反应的重要介体。值得注意的是,总CD4中的IL8血清水平和IL8信号通路+ 细胞在我们的MBL队列中增加了。我们的结果也在一项独立的蛋白质组学研究中得到了验证,该研究表明与HMGB1信号通路相比,MBL的血清IL8水平与对照组相比尤其升高(数据未显示)。 MBL的这一炎症轴可能是由可能与疾病发展有关的病原体刺激单核细胞PRR引发的。还报道了可以结合PRR并激活B细胞的自身抗原的作用[33]。从这个意义上讲,促炎环境的维持(如白血病前个体在此处确定的环境)可能有助于肿瘤转化。这些结果与以前的研究一致,表明自身或外源抗原在CLL发生中起关键作用[2,20,34-36]。在这方面,在CLL诊断之前几年就已经描述了免疫刺激的存在[37],并且对克隆扩增的敏感性增加与疾病的发展有关[38]。
      令人惊讶的是,我们还证明了在早期CLL中上述炎症驱动降低。具体而言,IPA预测与MBL相比,CLL中IL8,IL5和IFNγ信号通路减少,并且与MBL相比,CLL血清中这三种细胞因子的水平也显着降低。与MBL相比,CLL中单核细胞上HLA-DR的表达也被认为是免疫激活的标志,因为它对于启动特异性免疫应答的抗原呈递至关重要,因此在CLL中也显着降低。这些差异可能是由于CLL中促炎性单核细胞功能降低和/或这些单核细胞亚群的百分比降低(与经典单核细胞相比,HLA-DR水平更高)引起的[39,40]。因此,应分离并进一步表征不同的单核细胞亚群,以阐明它们在MBL和CLL发病机理中的不同作用。这些尚未发现的发现,连同基因表达和细胞因子结果显示MBL中促炎途径的增加,不仅可能反映出随着肿瘤进展的免疫抑制增加,而且还反映了MBL中免疫系统的刺激。
      另外,MBL受试者的炎症特征在M-CLL中尤其减少。与此相符,正在进行的另一项蛋白质组学分析预测,与MBL相比,M-CLL中IL8和HMGB1信号通路的抑制作用显着,如本研究中的细胞因子免疫分析所证实的。正在进行的蛋白质组学分析还支持M-CLL患者而非U-CLL可能是MBL中观察到的炎症驱动力降低的原因(未发表的结果)。在U-CLL患者中观察到的克隆细胞更依赖于环境生存信号[41],因此与M-CLL克隆相比,其与免疫环境的相互作用更为活跃。这些相互作用可能暗示HLA分子呈递的同源抗原,这可能解释了我们先前关于M-CLL中单核细胞HLA-DR表达降低的观察结果。尽管如此,与M-CLL相比,具有突变IGHV基因的MBL受试者显着过表达单核细胞HLA-DR,这表明另一种机制而不是无能和小B细胞克隆的刺激可以解释MBL中的单核细胞激活。另一方面,在U-CLL中,B细胞受体(BCR)信号传导可以刺激细胞因子的产生,例如IL8或CCL3 [42,43]。在我们的研究中,与MBL相比,M-CLL中两种细胞因子的水平均显着降低,但是在U-CLL和MBL受试者中观察到相似的水平升高,独立于其IGHV突变状态,表明这种炎性信号是MBL特异性的。在这方面,恶性细胞产生的BCR依赖性细胞因子可能取决于它们与免疫环境相互作用的能力,这在M-CLL和大多数MBL病例中可能受到限制,因为其中75-80%的患者显示IGHV突变[ 15、44]。因此,在MBL中观察到的增加的炎性分子可能是由免疫环境而不是新兴的相对较小的B细胞克隆主动产生的。循环CD4的基因表达结果+ cells of the present study showing increased inflammatory pathways also SUPport this hypothesis.
      我们还报道了MBL患者的克隆B细胞与自体CD14富集细胞的共培养可增强肿瘤细胞的生存能力。 这一发现表明,单核细胞中的单核细胞基因程序和相关的过度表达的炎症基因可能不是单核细胞抗肿瘤作用的整体结果。 从这个意义上讲,CLL先前曾报道过单核细胞/巨噬细胞谱系的肿瘤支持作用[30,45-47],而我们目前的发现将这种保护作用扩展至MBL。另外,在MBL和早期CLL中类似地观察到单核细胞对肿瘤存活的影响。由于前者表现出增加的炎性特征,因此这些可能与可能与近期恶性转化相关的抗原刺激增加有关,而不是与MBL中单核细胞的肿瘤支持作用增加有关。但是,不能排除其中某些炎症分子充当肿瘤生存前信号的可能性。 It is also worth mentioning that in healthy conditions, macrophages promoted BCR-stimulated B cell proliferation [48] 和 monocytes exerted SUPporting effects on normal B cell survival [49]. In our experiments, monocytes from MBL 和 CLL patients increased normal B cell viability (median: 60% in total PBMCs vs. 40.7% in CD14-depleted PBMCs, P-值=0.043), which also suggests that SUPporting interactions between monocytes 和 B cells are not unique to tumor B cells. Therefore, culturing monocytes from healthy controls, MBL subjects 和 CLL patients together with the same tumor B cell clone would be helpful to definitely clarify if the differences in the inflammatory features that we observed among the three groups could be attributed to differences in tumor-supporting effects of monocytes.
      我们的发现还表明CD4+ MBL和早期CLL的T细胞偏向Th1。我们观察到Th1基因上调[26]和CXCR3增加+CD4+ T细胞,通常被认为是Th1细胞[27,28]。此外,MBL受试者的血清IFNγ,CXCL9-11,IL8或TNFα水平升高,与Th1-单核细胞反应有关。据我们所知,这是CD4首次发挥作用 + Th1细胞已在MBL中进行了描述,尽管先前在CLL中的研究表明Th2极化[4, 50]。但是,其他研究也描述了在疾病早期Th1占主导地位[51],这与我们的结果一致。值得注意的是,Th1细胞可以与单核细胞/巨噬细胞相互作用,从而在B细胞肿瘤中诱导特定的抗肿瘤反应[52],最近一项关于CLL的研究表明Th1免疫的激活与来那度胺的临床反应有关[53]。在该疾病的小鼠模型中还描述了巨噬细胞的杀肿瘤作用[54]。因此,我们在MBL中观察到的Th1单核细胞特征可能会抑制恶性肿瘤的扩散。但是,当我们与其他PBMC一起培养肿瘤细胞时,与没有CD14的相同细胞培养相比,观察到了肿瘤活力的提高+ 细胞,提示T细胞与单核细胞之间的相互作用可能赋予保护性 而不是抗肿瘤 在MBL和早期CLL中的角色。
      此外,我们发现CD4增加+ 在MBL和早期CLL中具有类似细胞毒性特性的T细胞。这些细胞毒性特征在CD14耗尽的CD4中得到了明确证实+ 通过qRT-PCR和CD4检测MBL受试者的T细胞+ 流式细胞仪检测MBL和CLL患者的T细胞。此外,我们的MBL组显示出较高的效应CD27中位数百分比CD4+ T细胞。与此相符,最近的一项研究表明CD27的水平升高CD4+ T细胞主要存在于MBL和增强型CD27中 颗粒酶B+CD4+ T细胞贯穿所有疾病阶段,包括MBL [55]。 CD4的频率增加+ 以前在MBL中没有描述过表达穿孔素的T细胞,尽管考虑到穿孔素与粒酶在相同的细胞毒性途径中协同作用也不足为奇。其他研究也描述了细胞毒性CD4+ CLL中的T细胞[56],它们能够杀死克隆B细胞[57]. All these findings emphasize the non-exclusive role of the immune environment in SUPporting clonal B cell survival, although the global effect in MBL 和 early-stage CLL may rather be tumor-supporting, as suggested by the cell culture assays of this study. As previously highlighted, isolation of the different CD4+ T细胞和单核细胞亚群的结果必须明确阐明它们对肿瘤发展的特定作用。
      两者合计,我们描述了MBL中主要由单核细胞精心安排的炎症反应增加,在早期CLL中减轻。 MBL中鉴定出的促炎性信号可能代表了该白血病前阶段自我/外部抗原刺激的积极作用,这可能与最近的恶性转化有关。相反,这些炎症分子与单核细胞的肿瘤支持作用有关的可能性不能被消除。这些发现为疾病的早期阶段提供了新颖的见解,这将使未来的研究发展起来,以完全了解其自然历史,并最终为CLL管理制定先发制人的策略。

      披露事项

      作者没有财务利益冲突。

      致谢

      The authors want to thank all patients 和 healthy volunteers for their participation in this study 和 Xavier Duran for statistical SUPport. G. Blanco was funded by a grant from Fundació La Caixa 和 Fundación Española de Hematología y Hemoterapia (FEHH-Janssen). This work has been SUPported by the following grants: PI11/1621, PI15/437 和 FEDER (PT13/0010/0005), Instituto de Salud Carlos III, Spanish Ministry of Economy 和 Competitiveness; “Xarxa de Bancs de tumors” sponsored by Pla Director d'Oncologia de Catalunya (XBTC); 2014/SGR585 和 2017/SGR437 from Generalitat de Catalunya.

      参考文献

      • 1
        te Raa GD,Tonino SH,Remmerswaal EB等。慢性淋巴细胞性白血病的特异性T细胞亚群改变是克隆大小依赖性的,并且不存在于单克隆B淋巴细胞增多中。白细胞淋巴瘤。 2012; 53:2321-2325。
      • 2
        Vardi A, Vlachonikola E, Karypidou M, et al. Restrictions in the T cell repertoire of chronic lymphocytic leukemia: high-throughput immunoprofiling SUPports selection by shared antigenic elements. Leukemia. 2017;31:1555-1561.
      • 3
        Farace F,Orlanducci F,Dietrich PY等。 B慢性淋巴细胞性白血病患者的T细胞库。体内多个T细胞克隆扩增的证据。 免疫学杂志。 1994; 153:4281-4290。
      • 4
        GörgünG,Holderried TA,Zahrieh D,Neuberg D,Gribben JG。慢性淋巴细胞性白血病细胞诱导CD4和CD8 T细胞基因表达的变化。 J临床投资。 2005; 115:1797-1805。
      • 5
        Ramsay AG,Johnson AJ,Lee AM等。慢性淋巴细胞性白血病T细胞显示免疫突触形成受损,可通过免疫调节药物逆转。 J临床投资。 2008; 118:2427-2437。
      • 6
        Ramsay AG,Evans R,Kiaii S,Svensson L,Hogg N,Gribben JG。慢性淋巴细胞性白血病细胞通过改变来那度胺可逆的Rho GTPase信号传导,诱导LFA-1定向的T细胞运动缺陷。血液。 2013; 121:2704-2714。
      • 7
        Riches JC,Davies JK,McClanahan F等。来自CLL患者的T细胞表现出T细胞衰竭的特征,但保留了产生细胞因子的能力。血液。 2013; 121:1612-1621。
      • 8
        Palma M,Gentilcore G,Heimersson K等。慢性淋巴细胞性白血病中的T细胞显示免疫检查点和激活标记的表达失调。血液学。 2017; 102:562-572。
      • 9
        Maffei R,Bulgarelli J,Fiorcari S等。慢性淋巴细胞性白血病中的单核细胞群显示出与吞噬作用和炎症有关的基因的组成发生改变和失调。血液学。 2013; 98:1115-1123。
      • 10
        严XJ,Dozmorov I,李W等。慢性淋巴细胞白血病中与结果相关的细胞因子簇的鉴定。血液。 2011; 118:5201-5210。
      • 11
        Sivina M,Hartmann E,Kipps TJ等。 CCL3(MIP-1α)血浆水平和慢性淋巴细胞白血病的疾病进展风险。血液。 2011; 117:1662-1669。
      • 12
        Wierda WG,Johnson MM,Do KA等。血浆白介素8水平可预测慢性淋巴细胞性白血病的存活率。 Br J Haematol。 2003; 120:452-456。
      • 13
        Rawstron AC,Bennett FL,O'Connor SJ等。单克隆B淋巴细胞增多和慢性淋巴细胞性白血病。 N Engl J Med。 2008; 359:575-583。
      • 14
        Landgren O,Albitar M,Ma W等。 B细胞克隆是慢性淋巴细胞性白血病的早期标志物。 N Engl J Med。 2009; 360:659-667。
      • 15
        Vardi A,Dagklis A,ScarfòL等。免疫遗传学表明并非所有的MBL都相等:克隆越大,与CLL越相似。血液。 2013; 121:4521-4528。
      • 16
        Straaf P,Shanafelt TD。单克隆B细胞淋巴细胞增多和早期慢性淋巴细胞性白血病:诊断,自然病史和危险分层。血液。 2015; 126:454-462。
      • 17
        ScarfòL,Dagklis A,Scielzo C,Fazi C,GhiaP。CLL样单克隆B细胞淋巴细胞增多:我们所有人都一定有吗?塞米恩癌症生物学。 2010; 20:384-390。
      • 18
        Rissiek A,Schulze C,Bacher U等。多维标度分析可识别慢性淋巴细胞白血病中循环T细胞的病理学和预后相关特征。 Int J Cancer。 2014; 135:2370-2379。
      • 19
        D'Arena G,Rossi G,Minervini MM等。 “临床”单克隆B淋巴细胞增多中的循环调节性T细胞。 Int J Immunopathol Pharmacol。 2011; 24:915-923。
      • 20
        Blanco G,Vardi A,Puiggros A等。在CLL样单克隆B细胞淋巴细胞增多和早期CLL中限制T细胞受体库。肿瘤免疫学。 2018; 7:e1432328。
      • 21
        Harris PA, Taylor R, Thielke R, Payne J, Gonzalez N, Conde JG. Research electronic data capture (REDCap) – A metadata-driven methodology 和 workflow process for providing translational research informatics SUPport. J Biomed Inform. 2009;42:377-381.
      • 22
        Irizarry RA,Hobbs B,Collin F等。探索,归一化和总结高密度寡核苷酸阵列探针水平数据。生物统计学。 2003; 4:249-264。
      • 23
        Johnson WE,Li C,Rabinovic A.使用经验贝叶斯方法调整微阵列表达数据中的批次效应。生物统计学。 2007; 8:118-127。
      • 24
        Ritchie ME,Phipson B,Wu D等。 limma为RNA测序和微阵列研究提供了差异表达分析技术。核酸研究。 2015; 43:e47。
      • 25
        Gene expression Omnibus, a public functional genomics data repository SUPporting MIAME-compliant data submissions. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo.
      • 26
        Ono C,Yu Z,Kasahara Y,Kikuchi Y,Ishii N,TomitaH。荧光激活的细胞分选,然后对来自人外周血的辅助T细胞亚型进行微阵列分析。 PLoS一。 2014; 9:e111405。
      • 27
        Bonecchi R,Bianchi G,Bordignon PP等。 1型T辅助细胞(Th1s)和Th2s趋化因子受体的差异表达和趋化反应性。 J Exp Med。 1998; 187:129-134。
      • 28
        Qin S,Rottman JB,Myers P等。趋化因子受体CXCR3和CCR5标记与某些炎症反应相关的T细胞亚群。 J临床投资。 1998; 101:746-754。
      • 29
        Brusa D,Serra S,Coscia M等。 PD-1 / PD-L1轴是慢性淋巴细胞性白血病中T细胞功能障碍的原因。血液学。 2013; 98:953-963。
      • 30
        范Attekum MHA,Terpstra S,Sliner E等。巨噬细胞通过依赖CCR1的翻译性MCL-1诱导慢性淋巴细胞白血病中的生存信号。癌基因。 2017; 36:3651-3660。
      • 31
        史蒂文斯(Stevens)WB,内蒂(Netea)MG,凯特(Kater)AP,范德韦尔登(Van der Velden WJ)。 “训练后的免疫力”:淋巴恶性肿瘤的后果。血液学。 2016; 101:1460-1468。
      • 32
        Yang H,Hreggvidsdottir HS,Palmblad K等。 HMGB1与Toll样受体4结合并激活巨噬细胞细胞因子释放需要一个关键的半胱氨酸。美国国家科学院院刊.2010; 107:11942-11947。
      • 33
        Suurmond J和DiamondB。全身性自身免疫性疾病中的自身抗体:特异性和致病性。 J临床投资。 2015; 125:2194-2202。
      • 34
        Fais F,Ghiotto F,Hashimoto S等。慢性淋巴细胞性白血病B细胞表达受限的突变和未突变抗原受体集。 J临床投资。 1998; 102:1515-1525。
      • 35
        十个Hacken E,Gounari M,Ghia P,Burger JA。在慢性淋巴细胞性白血病中B细胞受体同型和定型的重要性。白血病。 2019; 33:287-298。
      • 36
        Lanemo Myhrinder A,Hellqvist E,Sidorova E等。一个新的观点:氧化的LDL,凋亡细胞和细菌上的分子基序是慢性淋巴细胞性白血病抗体的靶标。血液。 2008; 111:3838-3848。
      • 37
        Tsai HT,Caporaso NE,Kyle RA等。在诊断慢性淋巴细胞性白血病之前长达9.8年的血清免疫球蛋白异常的证据:一项前瞻性研究。血液。 2009; 114:4928-4932。
      • 38
        Glenn MJ,Madsen MJ,Davis E等。高风险的慢性淋巴细胞性白血病家系的亲戚中,IgM升高和异常轻链比例升高。血癌杂志.2019; 9:25。
      • 39
        Thomas GD,Hamers AAJ,Nakao C等。人血单核细胞亚群:一种新的门控策略,使用通过细胞计数仪鉴定的细胞表面标志物定义。动脉血栓栓塞血管生物学。 2017; 37:1548-1558。
      • 40
        Mukherjee R,Barman PK,Thatoi PK等。非经典单核细胞显示出炎症特征:在败血症和系统性红斑狼疮中验证。 2015年; 5:13886。
      • 41
        Coscia M,Pantaleoni F,Riganti C等。 IGHV未突变的CLL B细胞比突变的CLL B细胞更容易发生自发凋亡,并容易受到环境生存信号的影响。白血病。 2011; 25:828-837。
      • 42
        Burger JA,Quiroga MP,Hartmann E等。慢性淋巴细胞性白血病B细胞在护士样细胞共培养物中和BCR刺激后高水平表达T细胞趋化因子CCL3和CCL4。血液。 2009; 113:3050-3058。
      • 43
        Pede V,Rombout A,Vermeire J等。 ZAP70在慢性淋巴细胞性白血病中的表达激活了NF-κB信号传导。 Br J Haematol。 2013; 163:621-630。
      • 44
        Morabito F,Mosca L,Cutrona G等。临床单克隆B淋巴细胞增多症与Rai 0慢性淋巴细胞白血病:细胞,细胞遗传学,分子和临床特征的比较。临床癌症研究。 2013; 19:5890-5900。
      • 45
        Reinart N,Nguyen PH,Boucas J等。在没有巨噬细胞迁移抑制因子的情况下,慢性淋巴细胞白血病的发展延迟。血液。 2013; 121:812-821。
      • 46
        Galletti G,Scielzo C,Barbaglio F等。靶向巨噬细胞可使慢性淋巴细胞性白血病对细胞凋亡敏感,并抑制疾病进展。 Cell Rep.2016; 14:1748-1760。
      • 47
        Galletti G,Caligaris-Cappio F和Bertilaccio MTS。 B细胞和巨噬细胞在慢性淋巴细胞白血病的发展和进程中走一条共同的道路。白血病。 2016; 30:2293-2301。
      • 48
        Craxton A,Magaletti D,Ryan EJ和Clark EA。巨噬细胞和树突状细胞对人类B细胞增殖的调控需要TNF家族配体BAFF。血液。 2003; 101:4464-4471。
      • 49
        Mueller CG, Boix C, Kwan WH, et al. Critical role of monocytes to SUPport normal B cell 和 diffuse large B cell lymphoma survival 和 proliferation. J Leukoc Biol. 2007;82:567-575.
      • 50
        Fayad L,Keating MJ,Reuben JM等。慢性淋巴细胞性白血病中白细胞介素6和白细胞介素10的水平:与表型特征和结局的关系。血液。 2001; 97:256-263。
      • 51
        Podhorecka M,Dmoszynska A,Rolinski J,Wasik E. B细胞慢性淋巴细胞性白血病中的T型1 /类型2亚群平衡-三色流式细胞仪分析。 Leuk水库。 2002; 26:657-660。
      • 52
        Haabeth OA,Lorvik KB,Hammarstrom C等。肿瘤特异性Th1细胞驱动的炎症可预防B细胞癌。 Nat Commun。 2011; 2:240。
      • 53
        Aue G,Sun C,Liu D等。肿瘤微环境中Th1免疫的激活与慢性淋巴细胞白血病对来那度胺的临床反应有关。 免疫学杂志。 2018; 201:1967-1974。
      • 54
        Wu QL,IN Buhtoiarov,Sondel PM,Rakhmilevich AL,Ranheim EA。活化的巨噬细胞在慢性淋巴细胞性白血病小鼠模型中的杀肿瘤作用。 免疫学杂志。 2009; 182:6771-6778。
      • 55
        SimõesC,Silva I,Carvalho A等。外周血Vδ1的定量和表型表征 +慢性淋巴细胞性白血病中的T细胞和单克隆B细胞淋巴细胞增多。细胞计数法B临床细胞计数。 2019; 96:164-168。
      • 56
        Porakishvili N,Roschupkina T,Kalber T等。扩充CD4+ B型慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)患者具有细胞毒性表型的T细胞。临床实验免疫。 2001; 126:29-36。
      • 57
        Porakishvili N,Kardava L,Jewell AP等。细胞毒性CD4+ B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者中的T细胞通过穿孔素介导的途径杀死。血液学。 2004; 89:435-443。

      作者贡献

      G.B.,A.P。和B.E.设计了整个研究,分析了所有数据并撰写了手稿。 G.B. A.P.处理了样品并进行了实验。 B.S.,G.F.,F.P。和N.C.参与了血清研究的设计和解释。 N.C.在讨论结果和撰写手稿方面做出了重大贡献。 L.N. M.A.分析了原始基因表达数据。 X.C. A.F.和A.F.帮助设计和分析流式细胞术实验。 E.P.有助于执行微阵列和qRT-PCR分析。 P.Y.C.有助于进行细胞因子免疫测定。 Y.K.帮助数据管理。 M.R.R.有助于样品处理。 E.G.,E.A.,K.R.R.,P.A。和F.B.提供了患者数据和样本。交流电帮助进行细胞培养测定。所有作者都阅读了该手稿的最新版本。

      附录。 补充材料